I antikken eksisterede der 2 veje med samme navn: "Via Labicana", da de startede to forskellige steder, men senere samledes til én vej, som gik sydpå ud af Rom mod byen Labico.

Den nordlige Via Labicana gik fra Porta Esquilina (som lå ved nutidens Via di San Vito og hvis rester idag kaldes "Gallienus-Buen") ned over det område, hvor Piazza Vittorio Emanuele II ligger, og løb omtrent ud ad Via Principe Eugenio til den krydser Via di Porta Maggiore og Viale Manzoni.

Her stødte den på den sydlige Via Labicana, som startede ved Colosseum og nogenlunde fulgte den nuværende Via Labicana's løb, som en snæver sti under Colle Oppio mod nord ud til den nuværende Piazza San Clemente og derpå videre som en smal og ujævn vej frem til Porta Labicana i Den Serviske Bymur, der lå omtrent der, hvor nutidens Via Iside ligger, og videre syd for området "Inter Duos Lucos" og det store landsted "Horti Lamiani et Maiani" til den lige efter Aqua Marcia's buer drejede nordpå for at møde den nordlige Via Labicana og som én vej fortsætte ud gennem akvædukternes buer (hvoraf senere 2 af Aqua Claudia's buer blev indføjet i Den Aurelianske Bymur i det 3.århundrede), og som en romersk landevej brolagt med store basaltfliser (som stadig er fritlagte og viser de dybe hjulspor efter århundreders trafik af hestevogne og oksekærrer) løbe sydpå mod byen Labico.

På sydsiden af Den Sydlige Via Labicana lå forskellige bygninger med tilknytning til Colosseum: en våbensmedie (Samiarium), en gladiatorkaserne (Ludus Magnus), et lille alter (Sac.Argeorum, Esquil.III) og en stor privatejendom, der senere blev omdannet til markedsplads (Domus et Forum Petronius Maximus). Endelig var der mange almindelige beboelsesejendomme og ved nutidens Piazza San Clemente det kejserlige møntværksted (Moneta Caesaris). Kort efter nutidens Piazza del Colosseo lå sidevejen Vicus Cornicularius med et lille gadealter.

I det 4. århundrede opstod nok den lille kirke Santi Marcellino e Pietro, som ligger på hjørnet af Via Merulana .

På nordsiden af vejen lå der mod vest på Colle Oppio's skråning kasernen "Castra Misenatium" og længere mod øst et Isis-tempel, som på Kejser Augustus' tid gav navn til området "III Regio Augustea, Isis et Serapis", fordi en ægyptisk koloni havde slået sig ned her og omkring Via Labicana og på skråningerne og en del af Oppio-højen havde bygget huse og templer, blandt andet for den ægyptiske gudinde Isis.